Rendimiento diagnóstico de respiradores para recolección y detección de SARS.

Oct 07, 2023

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 13277 (2023) Citar este artículo

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Se han utilizado respiradores, llamados mascarillas, para proteger al usuario del aire exterior dañino y evitar que se libere cualquier virus a los vecinos a través del aliento exhalado potencialmente infectado. La eficacia antiviral de los respiradores no sólo ha sido investigada científicamente, sino que también se ha convertido en un problema mundial debido a la obligación de la sociedad de usar respiradores. En este artículo, informamos los resultados de un estudio sobre la recolección y detección de virus contenidos en el aliento exhalado mediante respiradores. El filtro electrostático interno fue cuidadosamente seleccionado para la recolección de virus porque no entra en contacto directo ni con la piel humana ni con el ambiente externo. En el estudio de un grupo de control sano, se confirmó que una gran cantidad de ADN y biomoléculas como los exosomas se recolectaban del respirador expuesto a la exhalación, y la cantidad de recolección aumentaba en proporción al tiempo de uso. Realizamos experimentos utilizando un total de 72 muestras pareadas con hisopos nasofaríngeos y muestras de respirador. De estas muestras, cincuenta dieron positivo para SARS-CoV-2 y veintidós dieron negativo. Los resultados de la PCR de las muestras de NPS y respiradores mostraron un alto nivel de concordancia, con un porcentaje de concordancia positivo de ≥ 90 % y un porcentaje de concordancia negativo de ≥ 99 %. Además, hubo un nivel notable de concordancia entre las pruebas de flujo RCA y la PCR al examinar las muestras de respiradores. Estos resultados sugieren que se trata de un método no invasivo, rápido y sencillo para recolectar muestras de sujetos que utilizan un respirador, lo que puede reducir significativamente la molestia de esperar en aeropuertos o lugares públicos y las preocupaciones sobre la contaminación cruzada. Además, esperamos que las tecnologías miniaturizadas integren la detección por PCR en los respiradores en un futuro próximo.

La infección por el coronavirus 2 (SARS-CoV-2), síndrome respiratorio agudo severo, se propagó por todo el mundo más rápido que cualquier otro virus, lo que se considera una característica de los virus respiratorios y del desarrollo del transporte. Inmediatamente después del brote, muchos países hicieron obligatorio el uso de respiradores, evitando en cierta medida la propagación de la infección. Como los artículos científicos informan que un respirador es eficaz para bloquear la propagación del virus1,2, usar una máscara se ha convertido en una etiqueta global básica en el escenario de una pandemia. Este fenómeno ha cambiado por completo el concepto de uso tradicional de mascarillas. En otras palabras, el propósito convencional de usar una máscara era proteger al usuario del aire externo nocivo. Sin embargo, el propósito del reciente uso obligatorio de mascarilla durante la pandemia es prevenir la propagación del virus a las personas que se encuentran alrededor del usuario a través del aire exhalado por este, que puede ser una fuente potencial de infección3. Esto comúnmente se conoce como control de fuente.

Vale la pena señalar la distinción entre mascarillas y respiradores, ya que el público en general ha utilizado comúnmente el término "mascarilla" sin una diferenciación adecuada. Esto ha generado confusión al definir las medidas de control de infecciones respiratorias, como distinguir entre respiradores y mascarillas. Para aclarar, una mascarilla está destinada a ser utilizada como medida de control de fuentes por parte del público en general y del personal de atención médica, según las regulaciones o recomendaciones durante la pandemia de COVID-194. Es importante tener en cuenta que las mascarillas pueden cumplir o no estándares específicos de barrera de fluidos o de eficiencia de filtración. Por tanto, no pueden servir como sustitutos de los respiradores o mascarillas quirúrgicas. Por otro lado, un respirador es un dispositivo de protección respiratoria diseñado para minimizar la exposición del usuario a contaminantes externos transportados por el aire, incluidos los virus presentes en el aliento exhalado5. Los respiradores, como las mascarillas N95 o KF94, deben estar certificados, seleccionados cuidadosamente y utilizados como parte de un programa integral de protección respiratoria. Es esencial reconocer que los respiradores con máscara filtrante (FFR) N95 y KF94 son un subconjunto de respiradores. Por último, las mascarillas quirúrgicas son resistentes a los fluidos y sirven como barreras físicas para proteger a los usuarios de peligros como salpicaduras de grandes gotas de sangre o fluidos corporales4. Estas mascarillas, etiquetadas como quirúrgicas, de aislamiento, dentales o para procedimientos médicos, están reguladas por el programa de certificación de la FDA. A lo largo de este artículo, utilizamos el término "respirador" para referirnos específicamente al FFR con certificación N95 o KF94.

Tenga en cuenta que los respiradores certificados N95 y KF94 constan de tres o cuatro membranas y utilizan filtración mecánica y electrostática en la membrana intermedia6. Una de las membranas intermedias utiliza fibras electret cargadas permanentemente como medio filtrante y puede recolectar el 95% de los virus en aerosol7. Debido a la naturaleza de los respiradores certificados, los virus expulsados ​​a través del aliento exhalado pueden recolectarse eficientemente en los respiradores8. Estudios recientes han informado que el ARN viral del SARS-CoV-2 se recolectó de respiradores y se cuantificó mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR)9,10,11. Además, se utilizaron respiradores faciales con sensores portátiles para la detección directa de virus recolectados del aliento exhalado del usuario12,13. También informamos datos preliminares para la recolección de virus utilizando un respirador y demostramos la viabilidad de detectar virus con métodos de RT-PCR o de amplificación de círculo rodante (RCA)14.

Algunos estudios han informado que el aliento exhalado se puede utilizar como muestra alternativa en lugar de hisopos nasofaríngeos (NPS) o saliva15,16. La prueba de aliento ha atraído durante mucho tiempo el interés por sus posibles aplicaciones en el diagnóstico médico y el seguimiento de enfermedades17. Este interés se debe principalmente a sus características de no invasividad y fácil muestreo, así como al muestreo repetitivo del aliento humano. Por lo tanto, el análisis del aliento a través de una nariz electrónica es una técnica orientada a la elaboración de perfiles de compuestos orgánicos volátiles (COV) en el aliento exhalado con fines de diagnóstico y pronóstico18. Este enfoque, cuando está respaldado por metodologías para la identificación de COV, a menudo se denomina metabolómica o respiraómica. Además, se han realizado esfuerzos para detectar la COVID-19 con nariz electrónica19. Sin embargo, el progreso del entorno de laboratorio a la práctica clínica habitual ha sido lento debido a varios problemas, incluidos los métodos de muestreo no estandarizados y las diferentes sensibilidades de los sensores adoptados. Además, el rendimiento diagnóstico de las narices electrónicas sin amplificación molecular ha sido inferior al de la PCR convencional. Dado que las pruebas de virus infecciosos como el COVID-19 no permiten resultados falsos superiores al 0,1% de sensibilidad, la nariz electrónica no se puede utilizar en la práctica clínica.

En un estudio preliminar reciente, investigamos el uso de la biopsia del aliento exhalado mediante respiradores como un posible método alternativo para la recolección de virus20. Nuestros hallazgos demostraron que la prueba de PCR basada en muestras de respiradores exhibió un rendimiento comparable a la prueba de PCR que utilizó muestras de hisopos nasofaríngeos. Estos resultados sugieren que la biopsia del aliento exhalado mediante respiradores podría ser un enfoque prometedor para la detección y el seguimiento del virus. Por lo tanto, llevamos a cabo un estudio clínico completo de recolección de respiradores de pacientes confirmados con infección por COVID-19, así como de controles sanos. Las muestras procesadas se examinaron con una RT-PCR certificada en comparación con muestras auténticas como NPS, como se muestra en la Fig. 1. Además, estos resultados de PCR con muestras de respiradores se compararon con el método RCA que se desarrolló en nuestro estudio anterior20,21 . Si tiene éxito, esta metodología puede proporcionar un protocolo de muestreo rápido y no invasivo en los puntos de atención y en los puntos de control de los viajes aéreos.

(a) Colección de virus desde la exhalación hasta la mascarilla. (b) Esquema de la extracción de ARN viral de la máscara. (c) Adopción de tres genes diana: N, E y RdRp para identificar el SARS-CoV-2. (d) Adopción de dos pruebas basadas en RCA. (1) Prueba RCA general (RCA-FL) que implica detección de fluorescencia mediante un dispositivo de PCR y (2) prueba rápida (RCA-Flow) que utiliza la formación de hidrogel de ADN en poros de microfluidos.

En la Fig. 2a se muestra el resultado de la comparación del perfil de ácido nucleico del ADN libre de células (ADNcf) extraído del plasma humano y el ácido nucleico extraído de un respirador usado durante 3 h. El cfDNA se distribuyó entre 100 y 300 pb, el ácido nucleico del respirador se distribuyó entre aproximadamente 200 y 300 pb. Además, al comparar cuantitativamente la distribución de estos ácidos nucleicos, como se muestra en la Fig. 2b, los ácidos nucleicos se distribuyeron principalmente entre 100 y 270 pb, y la concentración del ácido nucleico del respirador fue cercana a la del cfDNA extraído del plasma. Por lo tanto, se estableció hasta cierto punto el método de extracción de ácidos nucleicos del respirador. Como se muestra en la Fig. 2c, la cantidad de ARN extraído aumentó casi linealmente con el tiempo de uso, y la cantidad de ADN extraído de los respiradores usados ​​durante más de 3 h fue incluso mayor que la del plasma. Por ello, recomendamos recoger los respiradores usados ​​por los pacientes durante más de 3 h.

(a) Comparación de perfiles de ácidos nucleicos de ácidos nucleicos extraídos de máscaras. (b) Comparación cuantitativa de la distribución de ácidos nucleicos (los ácidos nucleicos se distribuyen principalmente en las proximidades de 100 a 270 pb). (c) Medición (cantidad) de la concentración de ácido nucleico recolectada según el tiempo de uso de la mascarilla. ( d ) Comparación de los valores de Ct de ácidos nucleicos para los tres genes constitutivos GAPDH, GUSB y RPLP0 en plasma y máscara humanos. (e) Resultados típicos de PCR de una muestra clínica de una mascarilla usada por un paciente con infección por SAR-CoV-2.

En este estudio, se utilizó RT-qPCR para tres genes constitutivos (GAPDH, GUSB y RPLP0) y se comparó con plasma humano para confirmar el rendimiento de extracción y la aplicabilidad de los ácidos nucleicos aislados de respiradores. Como se muestra en la Fig. 2d, para cada gen de mantenimiento, el valor Ct del ácido nucleico aislado del respirador se midió a un nivel casi similar al del plasma; así, pudimos confirmar nuevamente el rendimiento de extracción del ácido nucleico del respirador. Además, confirmamos que se extrajo una cantidad suficiente de ácido nucleico para utilizarlo en el diagnóstico molecular. La Figura 2e muestra resultados típicos de PCR en los que se recolectaron muestras clínicas de respiradores usados ​​por pacientes infectados con SAR-CoV-2. La señal de control interno se observó por primera vez en el ciclo 24.3, mientras que las señales para los genes RdRp, N y E se observaron en los ciclos 34.6, 37.1 y 37.6, respectivamente. Los resultados actuales del respirador son idénticos a los resultados de la PCR para la muestra de NPS. En conclusión, confirmamos que la recolección de virus mediante respiradores es posible y puede usarse para el diagnóstico.

Como se muestra en la Fig. 3a, la cantidad de ácido nucleico disminuyó con el tiempo en comparación con la cantidad de ácido nucleico el día de la recolección. Además, se realizaron pruebas de PCR en el gen objetivo utilizando muestras clínicas extraídas del respirador cada día de recolección para confirmar cada valor de Ct. Como se muestra en la Fig. 3b, el valor de Ct aumentó. Al igual que en los resultados cuantitativos, la cantidad de ácidos nucleicos estaba disminuyendo. Por lo tanto, observamos que la cantidad de ácido nucleico y el rendimiento de detección disminuyeron a medida que transcurría la fecha de recolección, e inferimos que la sensibilidad se puede mejorar si el cronograma de muestreo es lo más temprano posible a partir de la fecha de infección viral confirmada.

(a) Línea de tendencia de la cantidad de ácidos nucleicos en muestras clínicas extraídas de mascarillas según cada día de recolección (n = 19). (b) Comparación de los valores de Ct para genes diana utilizando muestras clínicas extraídas de máscaras en cada día de recolección. (c) Comparación de la cantidad de ácidos nucleicos extraídos de hisopos de garganta, saliva y mascarillas. (d) Comparación de valores de Ct para genes diana utilizando muestras clínicas extraídas de diferentes muestras.

Se compararon respectivamente las cantidades de ácidos nucleicos extraídos de hisopos de garganta, saliva y respiradores. Como se muestra en la Fig. 3c, las cantidades fueron 94,6 ng/μL en el hisopo de garganta, 104,9 ng/μL en la saliva y 124,0 ng/μL en el respirador. La muestra utilizada para esto fue la muestra del día de la recolección y N = 3. La Figura 3d muestra el valor de Ct obtenido al realizar la PCR en el gen diana utilizando la muestra clínica extraída de cada muestra. Como resultado, los valores respectivos de Ct fueron 28,41, 29,46 y 30,95, confirmando que no hubo diferencia significativa según el tipo de muestra. En general, podemos predecir que el rendimiento de recolección de ácido nucleico del respirador no es significativamente diferente del método convencional utilizado para la recolección de muestras.

Como se muestra en la Tabla 1, realizamos experimentos utilizando un total de 72 muestras pareadas (NPS y respirador), y los resultados se presentan en la Tabla 1. Entre las 72 muestras, se recolectaron 50 muestras positivas de pacientes que dieron positivo en la prueba de SARS-CoV. -2 mediante una prueba PCR previa a su ingreso hospitalario. En cambio, se recogieron 22 muestras negativas de pacientes que ya estaban ingresados ​​en el hospital por motivos ajenos al COVID-19 y confirmados negativos mediante la prueba PCR. De los 72 pacientes hospitalizados, recolectamos dos tipos de muestras, a saber, muestras de NPS y de respiradores, el primer día después de la hospitalización. Como se muestra en la Tabla 1, el muestreo de NPS combinado con la prueba RT-PCR, que se adoptó como método de referencia para comparar el rendimiento diagnóstico de los respiradores, reconfirmó 50 de los 50 verdaderos positivos y 22 de 22 verdaderos negativos. Con respecto a las pruebas de muestras de respiradores, de las 50 muestras positivas verdaderas, 45 fueron identificadas como positivas y las 22 muestras negativas verdaderas fueron identificadas correctamente como negativas. En consecuencia, la sensibilidad y especificidad correspondientes se calcularon como 90% y 100%, respectivamente.

Las muestras de respirador se evaluaron con prueba de RT-PCR y flujo RCA, como se enumera en la Tabla 2. Vale la pena señalar que las muestras utilizadas en la Tabla 2 fueron un subconjunto de las muestras utilizadas en la Tabla 1. Los resultados TH de RT-PCR fueron Se utiliza como referencia para evaluar el rendimiento diagnóstico de la prueba de flujo RCA. Entre los 26 resultados positivos de RT-PCR, 24 fueron positivos y 2 negativos en la prueba de flujo RCA, mientras que los 22 resultados negativos en RT-PCR fueron negativos en la prueba de flujo RCA. Por tanto, la sensibilidad y especificidad fueron numéricamente del 92,3% y 100%, respectivamente. En la literatura que evalúa el análisis comparativo y el rendimiento clínico del kit de PCR en tiempo real Allplex 2019-nCoV (Seegene, Seúl, Corea) y varios kits de RT-PCR, la sensibilidad de detección de muestras positivas osciló entre 92,8% y 95,9%22. Estos resultados indican que el rendimiento del flujo RCA no es significativamente diferente de los resultados de diagnóstico de la RT-PCR, considerando que el flujo RCA es una técnica de diagnóstico basada en pruebas en el lugar de atención.

En este estudio, nuestro objetivo era explorar la viabilidad de utilizar respiradores como herramienta de recolección de virus para simplificar el complejo e inconveniente protocolo actual de recolección de muestras. Se encontró que la sensibilidad de la detección del SARS-CoV-2 utilizando muestras extraídas de respiradores era el 90% de la de las muestras de hisopos nasofaríngeos utilizadas como punto de referencia en este estudio. Estos hallazgos difieren de los informados en un estudio reciente23, lo que podría atribuirse a diferencias en el tiempo de uso del respirador y al tamaño de la muestra. Por ejemplo, el tiempo de uso del respirador se limitó a 30 a 60 minutos, mientras que nuestro estudio requirió un mínimo de 3 h. Como se ilustra en la Fig. 2c, la cantidad de ARN extraído aumentó casi linealmente con el tiempo de uso. Además, pueden haber surgido discrepancias entre los dos estudios debido a diferencias en el tiempo de recolección de muestras desde la fecha de detección de COVID-1924. Como se muestra en la Fig. 3a, la cantidad de ARN extraído de la muestra del respirador disminuye exponencialmente con el tiempo. Con el paso del tiempo, los valores de PCR Ct siguen aumentando y pueden superar el valor de corte de diagnóstico (Fig. 3b).

Una característica importante de los respiradores es que están expuestos a un gran volumen de aire respirado durante períodos prolongados. La cantidad de aliento exhalado suministrado a un respirador por hora varía entre los individuos, pero en promedio es de aproximadamente 450 L en reposo. Por lo tanto, si se recolecta durante aproximadamente 3 h, asciende a 1350 L. Por el contrario, el volumen máximo de aire que se puede recolectar de una vez usando dispositivos oscila entre 0,2 y 3 L, lo que podría resultar en una baja sensibilidad para identificar pacientes infectados23. Además, los respiradores pueden capturar una gran cantidad de virus y esta carga viral continúa aumentando durante hasta 4 h (Fig. 2b).

Este estudio demostró que los virus respiratorios de personas infectadas se pueden recolectar eficazmente con respiradores certificados como KF94 o N95. Los resultados de este estudio sugieren cuán importante es el equipo de protección personal (EPP) para prevenir la propagación de virus infecciosos y para el aislamiento personal. Aunque muchos estudios han informado que los respiradores pueden bloquear los aerosoles respiratorios2,8, este estudio confirmó la acumulación de virus respiratorios en los respiradores. En otras palabras, el virus respiratorio que se libera continuamente al exterior de la persona infectada a través de la respiración se puede confinar eficazmente con el respirador. Sin embargo, una limitación potencial de este estudio es el riesgo de contaminación de la mascarilla por parte de los participantes o fuentes externas durante el proceso de ponerse y quitarse la mascarilla, que puede incluir el contacto inadvertido con manos contaminadas. El riesgo de dicha contaminación aumenta con el uso prolongado de mascarillas (más de 6 h) y tasas más altas de contacto clínico25. Para mitigar este riesgo, los protocolos relacionados con la duración del uso de mascarillas deben especificar un tiempo máximo para el uso continuo y considerar pautas adaptadas a entornos de alto contacto.

Sin embargo, en este estudio se identificaron varios problemas en el muestreo de respiradores y es necesario abordar el desarrollo de un nuevo método para extraer de manera eficiente el ARN viral de diferentes respiradores. Específicamente, las muestras del respirador se compararon con otros fluidos biológicos como saliva, moco y esputo, incluido NPS, para comparar la capacidad de captura y extracción de ácidos nucleicos. Al compararlas con muestras que pueden probarse clínicamente, propusimos otro método de diagnóstico molecular para el diagnóstico de virus. Vale la pena investigar en el futuro la capacidad de detectar ácidos nucleicos en los filtros de los respiradores, y un estudio confirmó que contienen una carga viral suficiente para permitir la detección positiva del SARS-CoV-2 en los resultados de experimentos de dispersión del coronavirus en los filtros de los respiradores20. Esto fue algo consistente con nuestros resultados. Por lo tanto, se recomienda encarecidamente la recolección y detección directa de virus a través de respiradores12.

Este estudio fue un estudio preliminar que utilizó muestras clínicas y tuvo algunas limitaciones. Primero, con respecto al tamaño de la muestra, reconocemos que el tamaño de la muestra fue relativamente pequeño. Esta limitación se debió principalmente a que el estudio se realizó en un hospital especializado con sistemas de presión negativa, donde nos centramos en pacientes diagnosticados en centros externos de detección de COVID-19. Este grupo limitado de pacientes clínicos contribuyó al tamaño limitado de la muestra. Además, otra limitación importante fue la consideración del riesgo potencial de infección y transmisión durante la recolección y preparación de muestras, particularmente en el acceso a las áreas de salas especializadas. Para garantizar la seguridad de los participantes, la Junta de Revisión Institucional (IRB) del hospital universitario recomendó reducir los ensayos clínicos a gran escala, lo que nos llevó a trabajar dentro de estas limitaciones. En consecuencia, pudimos incluir un total de 50 muestras clínicas en nuestro estudio después de excluir cualquier muestra no calificada. Es importante destacar que este tamaño de muestra se alinea con la cantidad predeterminada de muestras aprobadas por el IRB. En segundo lugar, este estudio no evaluó la eficiencia de filtración de las mascarillas como lo han hecho otros estudios. Si bien reconocemos la importancia de tales evaluaciones, nos gustaría aclarar que nuestra investigación se centró principalmente en evaluar el rendimiento diagnóstico de las mascarillas en lugar de evaluar la eficiencia de filtración de las mascarillas. Sin embargo, es importante señalar que en nuestro borrador original mencionamos explícitamente el uso de respiradores certificados KF94 (o N95), que han sido sometidos a una rigurosa validación de su eficiencia de filtración. Además, estudios recientes han indicado que las mascarillas con certificación N95 demuestran una eficiencia de filtración que oscila entre el 95 y el 99,2%7,26. Con base en este informe, reafirmamos que la mayoría de los virus exhalados serían capturados por las máscaras certificadas N95 que empleamos en nuestro estudio.

Además, la evaluación de la eficiencia de extracción de partículas virales de la máscara es un aspecto crucial de nuestro estudio. En Información complementaria, describimos y comparamos ampliamente dos métodos (Figs. S1 y S2) para extraer ARN viral de los respiradores. En el método descrito en la Fig. S1, utilizamos una jeringa de 10 ml para contener la capa de filtro de la mascarilla con Trizol, lo que permitió la recuperación de partículas de coronavirus de las mascarillas. Sin embargo, mejoramos aún más la recuperación de partículas de virus en las figuras S2a a d al adoptar un tubo de centrífuga con jeringa especialmente diseñado. Este nuevo protocolo mostró un aumento moderado en la recuperación de líquido, como se muestra en la Fig. S2e. Es importante destacar que demostró una mejora significativa en el rendimiento de ARN viral, como se muestra en la figura S2f. Creemos que la mejora observada en el rendimiento de ARN viral se puede atribuir a la tensión superficial dominante dentro de los poros de la membrana del filtro de la máscara, un fenómeno que ya aclaramos previamente en nuestra investigación27.

Más importante aún, las pruebas RCA pueden proporcionar falsos positivos; por lo tanto, se debe desarrollar una unión al objetivo más específica para un diagnóstico preciso. Actualmente se están llevando a cabo planes de mejora y experimentos de verificación, y pronto publicaremos los resultados para sugerir una alternativa estable. Además, la sensibilidad y la especificidad son criterios críticos en el diagnóstico molecular. Aunque la investigación aún está en sus inicios, este enfoque innovador representa un punto de inflexión refrescante y proporciona nuevos conocimientos para el futuro.

A través del presente estudio, pudimos identificar varias direcciones futuras potenciales para la recolección y detección de virus respiratorios. Un área crucial de atención es la optimización y estandarización de los protocolos de extracción de mascarillas para mejorar la eficiencia de la recuperación de partículas de virus. Esto implicaría explorar enfoques y tecnologías innovadores para mejorar la captura y recuperación de ARN viral, como la utilización de materiales novedosos para filtros de mascarillas. Una vía prometedora es el uso de membranas poliméricas solubles en agua, que podrían facilitar la extracción de partículas de virus de los filtros de las mascarillas de forma rápida y sencilla. Además, la integración de sensores portátiles innovadores o aparatos de detección inmediata tiene un gran potencial. Por ejemplo, la prueba de flujo RCA, como ejemplo de integración del método RCA con microfluidos avanzados, podría mejorarse aún más incorporando biosensores eléctricos. Esta integración permitiría la detección en tiempo real y en el sitio directamente dentro de un respirador con máscara12,13. El líquido requerido para el proceso de detección podría obtenerse a partir de la humedad del aliento exhalado utilizando polímeros superabsorbentes.

Todos los procedimientos realizados en este estudio, incluidos los participantes humanos, cumplieron con los estándares éticos institucionales y/o del consejo nacional de investigación y los de la Declaración de Helsinki de 1964 y cualquier revisión posterior o estándares éticos similares. El protocolo del estudio fue aprobado por las Juntas de Revisión Institucional del Hospital Guro de la Universidad de Corea (N.º de aprobación: 2021GR0092) y el Hospital Universitario de Konyang (N.º de aprobación: KYUH 2020-12-018-003). Los datos utilizados en este estudio se describen en Información complementaria. Todos los experimentos se realizaron en cinco repeticiones (n = 5) en cada condición durante todo el estudio.

Se recolectaron respiradores faciales de pacientes con infección por SARS-CoV-2 identificados mediante pruebas PCR oficiales en el Centro de Tratamiento de Estilo de Vida COVID-19 operado por el Hospital Kuro de la Universidad de Corea y el Hospital Universitario de Kongyang. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes, se solicitó a los pacientes que usaran respiradores por hasta 4 h. Las muestras clínicas para el experimento se obtuvieron de pacientes hospitalizados (n = 72, hombres 40, edad = 68,7 ± 12,7 años), incluidos individuos confirmados positivos para SARS-CoV-2 (n = 50), así como controles negativos (n = 22), como se describe en la Tabla 1. La concordancia de la prueba entre la prueba de PCR y la prueba de flujo RCA se evaluó utilizando las mismas muestras de máscara, como se presenta en la Tabla 2. Sin embargo, debido al aumento en el número de pruebas (PCR vs. RCA- flujo) para los tres genes diana virales (genes R, N, RdRp) y la disponibilidad limitada de muestras extraídas, el número total de muestras positivas se redujo a 26. Por lo tanto, las muestras utilizadas en la Tabla 2 fueron un subconjunto de las muestras utilizadas en la Tabla 1. Además, se recolectaron con éxito muestras de mascarillas de 19 de los 50 casos confirmados de SARS-CoV-2 durante tres días consecutivos (n = 19), como se muestra en la Fig. 3. Todos los respiradores tenían la certificación KF94 y aprobado por la Administración de Medicamentos y Alimentos de EE. UU. (FDA), así como por la FDA de Corea. Estos respiradores se recogieron cuidadosamente en bolsas de plástico esterilizadas y se almacenaron inmediatamente en un congelador a -80 °C. Las muestras que no cumplieron con los criterios de exclusión fueron excluidas de este estudio. Los criterios de exclusión para la recolección y almacenamiento de muestras son los siguientes: (1) Si el respirador no fue usado por un paciente confirmado con COVID-19; (2) El respirador se usó durante un tiempo insuficiente (t > 4 h); (3) No se alcanzó la temperatura de almacenamiento (< 80 °C) después de la recolección de la muestra.

La Figura 1b muestra el proceso de extracción de ARN viral de un respirador. Para identificar el SARS-CoV-2, adoptamos cuatro genes diana: los genes N, E, RdRp y ORF1ab (Fig. 1c). Estos genes diana se utilizan en muchos ensayos disponibles comercialmente. Por ejemplo, los reactivos de PCR comerciales se adquirieron en Seegen. Los reactivos eran para los genes N, E y RdRp como genes diana. Como se muestra en la Fig. 1d, adoptamos dos pruebas adicionales basadas en pruebas de flujo RCA-FL y RCA. La prueba RCA-FL es una prueba RCA común con detección de fluorescencia mediante un dispositivo de PCR, y la prueba RCA-flow es una prueba rápida que utiliza la formación de hidrogel de ADN en poros de microfluidos19. KF94 es al menos tan bueno como N95 para bloquear partículas de SARS-CoV-2, ya que el número 94 indica la eficiencia de filtración. Antes de examinar los respiradores de los pacientes, examinamos el efecto del tiempo de uso del respirador sobre la cantidad de ácidos nucleicos recolectados de los respiradores de los controles sanos. Tenga en cuenta que el aliento exhalado incluye diversas sustancias como ADN, ARN, exosomas y diversos compuestos orgánicos volátiles28.

El ADN libre de células (cfDNA) es un subconjunto de ADN extracelular circulante en el plasma, que se libera de las células principalmente a través de apoptosis, necrosis y secreción activa. El cfDNA tiene un potencial único como biomarcador para pacientes con cáncer o en el campo de la atención prenatal. El cfDNA extraído se cuantificó utilizando métodos del sistema TapeStation. Estudios recientes han detectado cfDNA circulante en el plasma de pacientes con varios tipos de cáncer. La distribución del tamaño del cfDNA fue mayoritariamente similar en el plasma de pacientes con cáncer y de donantes sanos, con un tamaño promedio de 150 a 200 pb20. El sistema TapeStation es una herramienta de electroforesis automatizada establecida para el control de calidad de muestras de ADN y ARN, y puede realizar análisis desatendidos de tamaño, concentración e integridad mediante un procesamiento de muestras totalmente automatizado. Proporciona una solución completa para un verdadero control de calidad de muestras de extremo a extremo dentro de cualquier secuenciación de próxima generación (NGS) o flujo de trabajo de biobanco y es muy adecuado para el control de calidad de muestras de ADN derivadas de datos clínicos.

El proceso de extracción de ARN del respirador es el siguiente. La parte exterior de la máscara recolectada se recortó para extraer el filtro de electreto interno, que posteriormente se cortó en dimensiones de 50 mm × 50 mm. Luego, el respirador cortado se colocó en 5 mL de Trizol, se incubó a temperatura ambiente (24 °C) durante 10 min y se rotó. Posteriormente, se drenó toda la solución del respirador mediante una ultracentrífuga. Posteriormente, dispense 200 ml de cloroformo en tubos de 1,5 ml. Agregar 1 mL de la mezcla extraída del respirador. La mezcla se agitó durante 15 s y se incubó a temperatura ambiente durante 5 min. Después de la centrifugación a 12.000 xg y 4 °C durante 10 minutos, solo se aisló el sobrenadante claro. Mezclar 500 µL de isopropanol con el sobrenadante, agitar la mezcla e incubar a temperatura ambiente durante 10 min. Centrifugar las muestras nuevamente a 12.000 xg y 4 °C durante 10 min, luego retirar el sobrenadante. El resto del proceso fue el mismo que el convencional. Después de agregar 1 ml de etanol al 75% al ​​ARN del cual se eliminó el sobrenadante, la mezcla se agitó y se realizó una centrifugación a 7500 xg, 4 °C durante 5 min, y luego se eliminó el sobrenadante (etanol) y Lavado dos veces dependiendo de la muestra. A continuación, se abrió la tapa de la mezcla y se secó durante 5 a 10 minutos (para eliminar completamente el etanol). Finalmente, después de dispensar y pipetear 15 µL de agua libre de RNasa (DW), la mezcla se incubó a 65 °C en un bloque calefactor durante 10 minutos, seguido de una incubación en hielo durante 2 minutos para extraer el ARN. Después de extraer el ARN del respirador de recolección de virus, se cuantificó con nanogotas y se evaluó la distribución del tamaño de los fragmentos con un instrumento 4200 TapeStation (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EE. UU.).

En este estudio, compramos un kit comercial de detección de SARS-CoV-2 (Allplex™ SARS-CoV-2 Assay, Seegene, Seúl, Corea) que ha sido aprobado por la FDA como caja de reactivos de diagnóstico de COVID-19 para uso de emergencia. Este producto es un kit de diagnóstico COVID-19 de amplificación genética en tiempo real (RT-PCR) que detecta tres genes objetivo (E, RdRp, N) para confirmar la infección por SARS-CoV-2. En Corea del Sur, el Ministerio de Seguridad de Alimentos y Medicamentos lo aprobó para uso de emergencia. La amplificación específica de alelo se realizó utilizando un sistema de PCR en tiempo real (CFX96 Touch™ Real-Time PCR, Bio-Rad) de la siguiente manera: Primero, se preparó una mezcla maestra de reacción. La mezcla maestra contiene 5 µL de SARS2 MOM, 5 µL de EM85 y 5 µL de agua libre de ARNasa para un volumen total de 15 µL de mezcla maestra. La cantidad total de cada reactivo requerida se calcula en función del número de reacciones, incluidas las muestras y los controles. Mezcla maestra en Vortex y centrifuga brevemente; agregue 15 μl de solución madre de reacción a tubos de 8 tubos de 0,1 ml (MicroAmp™ Fast 8-Tube Strip, 0,1 ml, Applied Biosystems™); agregue 5 μL de ácido nucleico de cada muestra en el tubo que contiene la mezcla maestra de reacción. Cierre la tapa de 8 tiras (MicroAmp™ Optical 8-Tube Cap Strip, Applied Biosystems™) y centrifugue el tubo de PCR brevemente. El líquido que contiene todos los componentes de la PCR se encuentra en el fondo de cada tubo de PCR.

El perfil térmico se configuró de la siguiente manera: ciclos de 20 min a 50 °C, ciclos de 15 min a 95 °C, luego 45 ciclos a 95 °C durante 10 s, 60 °C durante 15 s y finalmente 72 °C durante 10 s. s. Los datos se analizaron utilizando el software Bio-Rad CFX Maestro con el umbral de ciclo (Ct) establecido en 200.

En la Fig. 4 se muestra un sistema de microfluidos integrado y sus resultados de detección. El sistema de microfluidos puede funcionar solo sin ningún equipo, como una bomba de jeringa o un tubo de conexión. Dado que el nivel de líquido en la cámara de muestra es más alto que el nivel de líquido en la otra cámara, el flujo es impulsado por gravedad al perforar la cubierta de goma. Sin embargo, cuando un patógeno objetivo, como el SARS-CoV-2, está presente en la muestra, se produce un hidrogel que tapa los microporos de la rejilla29. Debido al pequeño tamaño de los microporos en la malla de nailon (aproximadamente 1 µm), estos microporos se bloquean rápidamente mediante el entrelazamiento del ADN mediante el proceso RCA. Las Figuras 4c yd muestran imágenes SEM de malla de nailon con gran aumento, mientras que la Fig. 4f muestra una fotografía del hidrogel formado por la reacción de RCA con ARN obtenido de muestras de respiradores clínicos. En particular, en ausencia de patógenos, hubo un flujo natural debido a la gravedad, y las pruebas repetidas indicaron un muy buen coeficiente de variación (<5%) para los tiempos de migración.

(a) Esquema del flujo RCA con microfluidos; (b) fotografía detallada de un tubo de ensayo acoplado con una malla de nailon a la unidad de detección de virus del chip de microfluidos; (c) y (d) son fotografías SEM con gran aumento de la malla de nailon que tiene poros a microescala; (e) esquemas de RCA sobre una superficie de malla de nailon; (f) foto de un hidrogel formado mediante reacción de RCA con ARN obtenido de una muestra de mascarilla clínica; (g) control negativo para el patógeno SAR-CoV-2 utilizando un chip de microfluidos; (h) control positivo para pacientes confirmados con SAR-CoV-2 utilizando un chip de microfluidos.

Para confirmar la detección del SARS-CoV-2 mediante muestras clínicas, comparamos los resultados del diagnóstico molecular con el método RCA. Cada uno de los tubos con una malla de nailon unida a un cebador se insertó en el kit de microfluidos. Esto puede ser confirmado por la información de nuestro estudio anterior14. Además, una muestra de ácido nucleico de un respirador de una persona normal se denominó control negativo. La ruta del flujo a través del respirador normal (control negativo) no se bloqueó completamente en un tiempo de incubación específico de 30 min colocando individualmente un patógeno COVID-19 específico en la entrada de ambos kits de microfluidos para lograr un flujo rápido (~ 17 s) a través el tubo de ensayo (Fig. 4g). Sin embargo, la ruta de flujo a través de la cual la muestra clínica de un paciente con corona confirmada pasó a través de la malla de nailon unida con cebador se bloqueó completamente y no se produjo flujo a lo largo de todo el tubo de ensayo (Fig. 4h).

Para la prueba de flujo RCA se empleó el sistema de microfluidos desarrollado en nuestro reciente estudio20,21. El sistema consta de una cámara de muestra, un tubo de vidrio, una malla de nailon conjugada con sonda y candado y una cámara de desechos con una cubierta de goma. Dado que la cámara de residuos está sellada con una tapa de goma, la muestra cargada en la cámara de muestras no puede fluir a través del tubo. Cuando la tapa de goma está conectada a la atmósfera, el fluido de muestra es conducido a la cámara de desechos debido al aumento de la presión hidrostática en la cámara de muestra. En esta prueba de flujo RCA, empleamos una rejilla muy delgada en la que sondas de candado fijas capturan el gen objetivo. La hibridación ocurre cuando la sonda encuentra el patógeno objetivo. La sonda de candado abierta se liga usando ligasa (ligasa T4, 12,5 μM) para formar una plantilla de circuito cerrado, que luego puede continuar con el proceso RCA. Con el tiempo, en el proceso RCA, el ADN monocatenario complementario se alarga hasta darle forma de mancuerna utilizando ADN polimerasa Bst 3.0. Debido a la plantilla en forma de mancuerna, el ADN largo amplificado tiende a enredarse fácilmente, agregarse con el ADN adyacente y formar geles de ADN. Como resultado, el hidrogel tapona parcial o completamente los microporos de la malla; por lo tanto, dependiendo del grado en que el hidrogel tapone los microporos, se produce un retraso en el flujo o no hay flujo. La información detallada está disponible en nuestros artículos anteriores20,21.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y sus archivos de información complementarios.

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Esta investigación fue apoyada por una subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el gobierno coreano, MSIP (RS-2023-00207833).

Estos autores contribuyeron igualmente: Hwang-soo Kim y Hansol Lee.

Departamento de Ingeniería de Micronanosistemas, Universidad de Corea, Seúl, 02841, República de Corea

Hwang-soo Kim y Sehyun Shin

Instituto de Influenza de Asia Pacífico, Facultad de Medicina de la Universidad de Corea, Seúl, 08308, República de Corea

Hansol Lee

División de Enfermedades Infecciosas, Departamento de Medicina Interna, Hospital Universitario de Konyang, Daejeon, 35365, República de Corea

Seonghui Kang

División de Enfermedades Infecciosas, Departamento de Medicina Interna, Facultad de Medicina de la Universidad de Corea, Seúl, 08308, República de Corea

Woo Joo Kim

Escuela de Ingeniería Mecánica, Universidad de Corea, Seúl, 02841, República de Corea

Sehyun Shin

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WJK y SS iniciaron la investigación. HL y HK realizaron los experimentos y analizaron los datos con el apoyo de SKHK y S. S escribieron el manuscrito con el apoyo de WJK. Todos los autores discutieron los resultados.

Correspondencia a Woo Joo Kim o Sehyun Shin.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Kim, Hs., Lee, H., Kang, S. et al. Rendimiento diagnóstico de respiradores para recolección y detección de SARS-CoV-2. Representante científico 13, 13277 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39789-w

Descargar cita

Recibido: 04 de abril de 2023

Aceptado: 31 de julio de 2023

Publicado: 15 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39789-w

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