Los motivos de bucle hidrofóbicos cortos en los dominios BRICHOS determinan la actividad de las chaperonas contra la agregación de proteínas amorfas pero no contra la formación de amiloide.

Apr 28, 2024

Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 497 (2023) Citar este artículo

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Las chaperonas moleculares independientes de ATP son importantes para mantener la aptitud celular, pero los determinantes moleculares para prevenir la agregación de sustratos proteicos parcialmente desplegados aún no están claros, particularmente con respecto al estado de ensamblaje y la base para el reconocimiento del sustrato. El dominio BRICHOS puede realizar funciones de chaperona similares a pequeños choques térmicos (sHSP) en grados muy diferentes dependiendo de su estado y secuencia de ensamblaje. Aquí, observamos tres motivos de secuencia hidrofóbica en dominios chaperonas activos y descubrimos que quedan expuestos en la superficie cuando el dominio BRICHOS se ensambla en oligómeros más grandes. Los estudios de variantes de intercambio de bucles y mutantes específicos de sitio revelaron además que las hidrofobicidades biológicas de los tres motivos cortos se correlacionan linealmente con la eficacia para prevenir la agregación de proteínas amorfas. Al mismo tiempo, no se correlacionan en absoluto con la capacidad de prevenir la formación ordenada de fibrillas de amiloide. Las correlaciones lineales también predicen con precisión las actividades de las quimeras que contienen motivos de secuencia hidrofóbica corta de una sHSP que no está relacionada con BRICHOS. Nuestros datos indican que los motivos hidrófobos cortos y expuestos reunidos por oligomerización son suficientes y necesarios para una actividad chaperona eficiente contra la agregación de proteínas amorfas.

Las chaperonas moleculares son fundamentales para la maquinaria de proteostasis al ayudar al plegamiento correcto de los polipéptidos1,2. Entre ellos, las chaperonas moleculares independientes de ATP, como las pequeñas proteínas de choque térmico (sHSP), previenen las consecuencias tóxicas de la agregación de proteínas al unirse a sustratos no plegados o mal plegados y mantenerlos en un estado soluble y competente para replegarse3,4. Bri2 es una proteína transmembrana de tipo II, expresada de forma ubicua, y su procesamiento proteolítico libera un dominio chaperona molecular: BRICHOS5,6. Curiosamente, otras chaperonas moleculares como HSP60, HSP70 y HSP90 son parte del interactoma Bri2 en el cerebro y la retina7,8. El dominio Bri2 BRICHOS aislado modula las vías de agregación de varios sustratos formadores de amiloide, evita la toxicidad asociada al amiloide y previene la agregación de proteínas amorfas no fibrilares, similar a las chaperonas moleculares independientes de ATP como las cristalinas o clusterinas9,10,11,12. 13. La capacidad del dominio Bri2 BRICHOS para interactuar con sustratos implicados en trastornos de agregación de proteínas como la enfermedad de Alzheimer14,15,16, la diabetes tipo II17 y la enfermedad de Parkinson18 resalta su importancia potencial para la proteostasis celular.

El dominio BRICHOS tiene un tamaño de aproximadamente 100 residuos de aminoácidos y existe como monómeros o multímeros que van desde dímeros hasta grandes oligómeros polidispersos estabilizados mediante interacciones covalentes y no covalentes11,19,20. Los dominios BRICHOS humanos Bri2 y Bri3 se ensamblan en grandes oligómeros de aproximadamente 20 a 30 subunidades, que inhiben eficazmente la agregación de proteínas amorfas. Por el contrario, los monómeros y dímeros Bri2 BRICHOS, así como el dominio BRICHOS de la proteína prosurfactante C (proSP-C), que existe principalmente como trímeros, son todos inactivos contra la agregación de proteínas amorfas9,11,19,20. Los dominios BRICHOS de diferentes familias tienen identidades de secuencia por pares bajas, pero los modelos de homología del monómero Bri2 BRICHOS basados ​​en la estructura cristalina proSP-C BRICHOS muestran una lámina β central conservada de cinco cadenas que está flanqueada por dos hélices α conectadas a través de una larga bucle flexible (Fig. 1a, b)19,20,21,22. Hasta la fecha, no hay ninguna estructura experimental con detalles atómicos disponibles para el dominio Bri2 BRICHOS, probablemente relacionado con el hecho de que la subunidad monomérica es conformacionalmente dinámica23 y que los oligómeros más grandes son polidispersos (ver más adelante).

una subunidad única de la estructura cristalina de los trímeros wt proSP-C BRICHOS (número de acceso de PDB: 2yad). La línea de puntos indica el bucle que falta en la estructura cristalina y su región central está marcada con una sombra azul. La secuencia está marcada en incrementos desde azul para residuos polares hasta rojo para residuos hidrofóbicos. b Wt Bri2 BRICHOS modelados por AlphaFold 2, donde el núcleo del bucle está etiquetado como en (a). c Secuencias de aminoácidos de regiones del bucle BRICHOS humano (consulte la Figura 1 complementaria para ver la alineación) codificadas por colores como en (a, b). Los dominios BRICHOS estudiados en este documento están en negrita, los motivos 1 a 3 están encuadrados y T206 se indica con una flecha. d Modelos esquemáticos de variantes de bucle de intercambio y delta. e SEC de variantes del oligómero BRICHOS (izquierda) y número estimado de subunidades (derecha). El número de subunidades se estimó a partir de los picos máximos de SEC (indicados por líneas centrales y números encima de los cuadros) y los cuadros representan su ancho total a la mitad del máximo.

Las chaperonas moleculares de sHSP independientes de ATP clásicas, como la αB-cristalina, se ensamblan en grandes complejos polidispersos y dinámicos y pueden unirse a un conjunto diverso de sustratos proteicos3,10. Los datos sugieren que la plasticidad estructural de las chaperonas moleculares independientes de ATP media la exposición de regiones de unión individuales para clientes amiloides o amorfos. Si bien los sitios de unión para los sustratos amiloides pueden depender del sustrato y del tipo de agregado fibrilar24,25, los dominios N-terminales (NTD) flexibles y parcialmente desordenados de las sHSP, enriquecidos en residuos hidrofóbicos, parecen importantes para la formación de compuestos de alto peso molecular. conjuntos de peso e interacción con sustratos modelo de agregación amorfa25,26,27,28,29.

En este estudio, nuestro objetivo fue comprender la arquitectura de los oligómeros del dominio Bri2 BRICHOS y definir el sitio de unión del cliente con respecto a la actividad chaperona contra la agregación de proteínas amorfas. Nuestros resultados muestran que tres motivos hidrofóbicos cortos en un bucle no estructurado del dominio Bri2 BRICHOS constituyen la región clave para estabilizar sustratos parcialmente desplegados contra la agregación de proteínas amorfas, son importantes para la plasticidad del oligómero pero no dictan la capacidad de retardar la formación de amiloide.

En la búsqueda de una explicación de los distintos comportamientos de las proteínas BRICHOS humanas en términos de actividad para prevenir la agregación de proteínas amorfas, reconocimos que el bucle que conecta las hélices α 1 y 2 contiene tres motivos tripéptidos hidrofóbicos en los BRICHOS Bri2 y Bri3 activos como acompañantes. mientras que los motivos correspondientes en proSP-C BRICHOS inactivos con chaperonas son polares y están cargados (Fig. 1a-c, Fig. Suplementaria 1). Para probar si el bucle define la capacidad de formar oligómeros y prevenir la agregación de proteínas amorfas, intercambiamos los bucles entre Bri2 humano y proSP-C BRICHOS, generando así variantes LS (intercambio de bucle) (Fig. 1d). Bri2 BRICHOS de Ictidomys tridecemlineatus (número de acceso NCBI: XP_013216182) y Octodon degus (número de acceso NCBI: XP_004633182) carecen del bucle completo, pero por lo demás son casi idénticos a los Bri2 BRICHOS humanos y aquí se los denomina bucle delta (ΔL) Bri2 BRICHOS (Fig. .1c, d, Figura complementaria 1). Los BRICHOS LS y ΔL Bri2 recombinantes exhiben perfiles de oligomerización similares en cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) y estructuras secundarias generales de oligómeros, dímeros y monómeros aislados como las contrapartes de BRICHOS Bri2 humano de tipo salvaje (wt)11 (Figuras complementarias 2a-f). LS proSP-C BRICHOS forma grandes oligómeros polidispersos unidos por enlaces disulfuro, además de trímeros y monómeros que se observan para el peso proSP-C BRICHOS19 (Figura complementaria 2g-i). Los oligómeros LS Bri2, LS proSP-C y ΔL Bri2 BRICHOS tienen en general menos subunidades (aproximadamente 12 a 24) que los oligómeros Bri2 BRICHOS wt (aproximadamente 18 a 30) (Fig. 1e).

A continuación, seguimos la cinética de agregación de los sustratos modelo citrato sintasa (CS) y rodanasa (Rho), que se despliegan y forman agregados amorfos a temperaturas elevadas, en ausencia y presencia de fracciones oligoméricas de todas las variantes del bucle BRICHOS. LS Bri2 y ΔL Bri2 BRICHOS tienen actividades significativamente reducidas contra CS (Fig. 2a, b, Fig. complementaria 3a, b) y Rho (Fig. complementaria 3c, d) en comparación con Bri2 BRICHOS wt. Por el contrario, LS proSP-C BRICHOS es igualmente eficiente que el wt Bri2 BRICHOS para prevenir la agregación de proteínas amorfas, mientras que los trímeros wt proSP-C BRICHOS carecen de actividad chaperona (Fig. 2a, b, Fig. complementaria 3a-d) 9. El análisis de las fracciones solubles e insolubles de CS después de que la agregación alcanzó una meseta corroboró que las proteínas que contienen el bucle hidrofóbico Bri2 BRICHOS son más potentes para mantener el sustrato en un estado soluble (Fig. 2c, d). LS Bri2 y ΔL Bri2 BRICHOS tienen cierta actividad residual en los ensayos de agregación de turbidez, en particular en proporciones equimolares entre CS y las proteínas BRICHOS (Fig. 2a, b, Fig. complementaria 3a-d), pero son completamente incapaces de mantener CS en solución (Fig. 2c, d). La razón de esta discrepancia aún no se ha determinado, pero LS Bri2 y ΔL Bri2 BRICHOS podrían afectar los tamaños de los agregados CS y Rho y, por lo tanto, reducir su capacidad para dispersar la luz. Para investigar más a fondo los efectos del bucle Bri2 BRICHOS sobre la capacidad de prevenir la agregación no fibrilar, se produjo una proteína de fusión que contiene la etiqueta de solubilidad inactiva de chaperona NT*30 y el bucle aislado (bucle NT*). Sorprendentemente, los oligómeros de bucle NT* (aproximadamente 20 subunidades, estimados por SEC) pueden reducir la agregación de CS en aproximadamente un 40%, mientras que los monómeros de bucle NT* están inactivos (Figura complementaria 3e). Aunque la eficiencia de las chaperonas de los oligómeros de bucle NT* es menor que la de los oligómeros Bri2 BRICHOS en peso, los resultados aún sugieren que acercar múltiples bucles Bri2 BRICHOS en los oligómeros de bucle NT* promueve colectivamente la actividad chaperona.

a Trazas de agregación de 1,2 µmol L-1 CS a 45 °C solo y con las diferentes variantes de bucle en una relación molar de 1:1 (CS:BRICHOS), codificadas por colores como en (b). Los rastros de agregación son de 2 a 3 réplicas. b Masa de agregación determinada a partir de las áreas bajo las curvas en (a). Los datos se presentan como medias ± desviaciones estándar y se normalizan únicamente a la masa agregada de CS. c Mezclas de CS con y sin variantes del bucle BRICHOS después de la incubación a 45 °C, o muestras frescas no incubadas, analizadas mediante SDS-PAGE. d Intensidades de las bandas en (c) evaluadas por ImageJ50 y normalizadas a la intensidad de las bandas de CS fresco.

Para evaluar si la actividad contra la formación de amiloide se ve afectada por la presencia del bucle, se utilizó tioflavina T (ThT) para rastrear la cinética de la formación de fibrillas Aβ4231. ΔL Bri2 BRICHOS, independientemente de su estado de ensamblaje, tiene una eficiencia similar contra la formación de fibrillas Aβ42 que los monómeros Bri2 BRICHOS wt (Figuras complementarias 4a, b). El ajuste cinético global de las constantes de velocidad microscópicas32,33,34 mostró que la nucleación secundaria y el alargamiento durante la formación de fibrillas Aβ42 se ven afectados de manera similar por ΔL Bri2 BRICHOS como se demuestra para wt Bri2 BRICHOS (Figuras complementarias 4c-e)11,15. Además, se probaron monómeros de bucle Bri2 BRICHOS aislados, monómeros u oligómeros de bucle NT * contra la formación de fibrillas Aβ42 a 37 ° C, una temperatura a la que el bucle aislado no está estructurado y es estable (Figura complementaria 3f). Los monómeros de bucle aislado o bucle NT * no mostraron ninguna capacidad para suprimir la formación de fibrillas Aβ42 (Figura complementaria 3g). Los oligómeros del bucle NT * retrasaron ligeramente la formación de fibrillas Aβ42, pero el efecto no dependió de la concentración (Figura complementaria 3h).

Los oligómeros Bri2 BRICHOS incubados junto con CS a temperatura elevada forman un complejo que puede aislarse mediante SEC (Figura complementaria 5a). SDS-PAGE del complejo aislado por SEC mostró dos bandas, correspondientes a CS y rh Bri2 BRICHOS, respectivamente, mientras que PAGE nativa solo reveló una banda (Figura complementaria 5b). La EM con tinción negativa de los oligómeros Bri2 BRICHOS y el complejo CS (Fig. 5c complementaria) muestra partículas que son estructuralmente diferentes de las observadas por la EM con tinción negativa de los oligómeros Bri2 BRICHOS solos11. Estos resultados sugieren que los oligómeros Bri2 BRICHOS pueden prevenir la agregación de proteínas amorfas formando complejos con sustratos parcialmente desnaturalizados. Para probar la accesibilidad al solvente del bucle Bri2 BRICHOS en oligómeros activos, diseñamos un sistema indicador basado en la fluorescencia de Trp (Fig. 3a). Dado que Bri2 BRICHOS no contiene ningún residuo de Trp, reemplazamos Thr en la posición 206, ubicada inmediatamente después del tercer motivo hidrofóbico en el bucle, con Trp (T206W) (Fig. 3b). Cuando se excitan a 280 nm, los oligómeros rh Bri2 BRICHOS T206W exhiben un máximo de emisión de fluorescencia de Trp a 330 nm, mientras que los monómeros presentan un máximo de emisión a 323 nm (Fig. 3a), lo que indica que el microambiente de Trp206 se vuelve más polar durante BRICHOS de monómero a oligómero. transformación. Estos hallazgos nos animaron a investigar con más detalle hasta qué punto los motivos hidrofóbicos en el bucle Bri2 BRICHOS son cruciales para su función de acompañante.

a Fluorescencia de Trp normalizada para monómeros y oligómeros rh Bri2 BRICHOS T206W. b Secuencias de aminoácidos de los motivos de bucle 1 a 3 mutantes (encuadrados), consulte la Fig. 1 para ver las secuencias de bucle completas. c Masa de agregación de 1,2 µmol L-1 CS a 45 °C en ausencia o presencia de los diferentes mutantes de bucle en una relación molar de 1:1 (CS:BRICHOS). La masa de agregación proviene de tres réplicas. Los datos se presentan como medias ± desviaciones estándar.

Creamos un conjunto de mutantes Bri2 BRICHOS con el objetivo de modular la hidrofobicidad y la carga de los tres motivos tripéptidos en el bucle (Fig. 3b). En cuatro mutantes, los residuos en diferentes motivos tripéptidos se mutaron a ácido glutámico-glicina-arginina (EGR) (Fig. 3b), como en el motivo 3 de proSP-C BRICHOS wt inactivo con chaperona (Fig. 1c, Fig. complementaria 1) . Tres mutantes más tienen reemplazos de residuos hidrofóbicos con los residuos más polares serina y alanina (SS y SAS), y el T206W, en contraste, es más hidrofóbico que la proteína wt (Fig. 3b). Todos los mutantes formaron oligómeros con estructuras secundarias similares a las de Bri2 BRICHOS wt, pero los tamaños promedio de todos los oligómeros mutantes fueron algo más pequeños que los oligómeros wt (Figuras complementarias 6, 7). Los mutantes que son menos hidrófobos que el wt Bri2 BRICHOS también fueron menos eficientes para inhibir la agregación amorfa termoinducida de CS y Rho, mientras que el mutante T206W más hidrófobo mostró una eficiencia ligeramente mayor (Fig. 3c, Fig. complementaria 8a, b).

Existe una correlación lineal fuerte y significativa entre la hidrofobicidad combinada general de los tres motivos del bucle y la eficiencia de acompañamiento contra CS y Rho desestabilizados (Fig. 4a, Fig. Suplementaria 8c, d). Aquí, las hidropatías se calcularon utilizando la escala de hidrofobicidad "biológica", que se deriva de la capacidad de cada residuo de aminoácido para insertarse en la membrana lipídica del retículo endoplásmico35. El uso de la escala de Kyte-Doolittle36 para describir la hidropaía de los motivos dio como resultado correlaciones cualitativamente similares (Figura complementaria 9). Esto sugiere que los oligómeros Bri2 BRICHOS reconocen regiones hidrofóbicas expuestas en los sustratos parcialmente desplegados principalmente a través de tres motivos hidrofóbicos cortos separados por segmentos polares o cargados cortos. Dado que la composición de residuos del bucle también afecta el grado de ensamblaje del oligómero (Fig. 1e), correlacionamos el número de subunidades constituyentes estimadas a partir de datos de SEC (Fig. 7a complementaria) con la actividad de las chaperonas, así como con la hidrofobicidad de los motivos del bucle. Para las actividades contra los sustratos CS y Rho, no existe correlación entre el número de subunidades en los oligómeros y la actividad de las chaperonas (Fig. 4b, Fig. complementaria 8e, f). Si el mismo análisis se restringe sólo a las variantes que contienen la estructura Bri2 BRICHOS, es decir, dejando fuera LS proSP-C BRICHOS, existe una débil tendencia a que los oligómeros más grandes sean más activos contra CS (R2 = 0,5, p < 0,05), pero aún no se encuentra correlación para la actividad contra Rho (R2 = 0,2, p = 0,19). No se detectó correlación entre las hidropatías del motivo y el número de subunidades constituyentes de los oligómeros chaperonas, aunque todos los oligómeros mutantes tenían tamaños promedio algo más pequeños que la contraparte wt Bri2 BRICHOS (Figura complementaria 8g). Por lo tanto, si bien los monómeros, dímeros y tetrámeros de Bri2 BRICHOS son completamente inactivos contra la agregación de proteínas amorfas, el número exacto de subunidades no determina la actividad de los oligómeros más grandes (Fig. 4b, Fig. Suplementaria 8e, f). De acuerdo con esta conclusión, se puede observar que los LS proSP-C BRICHOS de alrededor de 12 unidades son igualmente eficientes que los oligómeros Bri2 BRICHOS wt que tienen aproximadamente el doble de subunidades (Figs. 1e, 2b, d).

a, b Análisis de correlación entre la masa de agregación y la hidropatía de los motivos 1-3 más T206 o W206, calculado utilizando la escala de hidrofobicidad biológica35 (a) y el número de subunidades en oligómeros calculado a partir de datos de SEC en la figura complementaria 7. (b). c Panel superior, secuencias de aminoácidos de bucles de wt Bri2, proSP-C y GKN2 BRICHOS, y los primeros 18 residuos del NTD de αB-cristalina (ver Figura complementaria 11a). Paneles medio e inferior, modelos esquemáticos de las quimeras αB Bri2 y αB proSP-C BRICHOS. d Regresiones lineales de las relaciones entre la masa de agregación de CS y la hidropatía derivadas de variantes de BRICHOS en 1:1 (datos de a, panel izquierdo) o 1:0,5 (datos de la Fig. 8c complementaria) Relaciones CS:BRICHOS, con una banda de confianza del 95% indicada por líneas discontinuas y sombras. Masas de agregación de CS determinadas experimentalmente en presencia de quimeras humanas GKN2 BRICHOS (verde), αB Bri2 (rojo) o αB proSP-C BRICHOS (azul claro) (proporciones de rombos 1:1, proporciones de círculos 1:0,5) trazadas con barras de error en los valores de hidropatía calculados para sus respectivos motivos combinados 1–3 (ver (b) para las secuencias). e Las masas de agregación de 1,2 µmol L-1 CS a 45 °C con y sin diferentes concentraciones de oligómeros de dominio Bri2 y proSP-C BRICHOS en peso, y oligómeros de quimera αB Bri2 y αB proSP-C BRICHOS. Los puntos de datos se ajustaron a funciones de decaimiento lineal o exponencial. Los datos se presentan como medias ± desviaciones estándar. Las actividades de la cristalina αB humana recombinante de los valores publicados39,40,41 se representan con círculos grises como referencia.

Todos los mutantes, así como ΔL Bri2 BRICHOS, fueron eficientes contra la formación de fibrillas Aβ42, aunque en diferentes grados (Figuras complementarias 4 y 10a-h). No se detectó correlación entre la capacidad de retrasar el tiempo medio de formación de fibrillas de amiloide (τ1/2) y (i) la hidropatía del motivo del bucle o (ii) el tamaño del oligómero (Figura complementaria 10i, j). Esto sugiere que, si bien la actividad chaperona contra la agregación de proteínas amorfas de los oligómeros BRICHOS se basa en regiones hidrofóbicas expuestas, el objetivo de la formación de amiloide se basa en otros principios. Esta conclusión concuerda bien con el hallazgo reciente de que la unión de la αB-cristalina a las fibrillas de α-sinucleína se produce a través de monómeros y está impulsada por la entropía en lugar de a través de oligómeros e interacciones hidrófobas38.

A continuación, preguntamos si las hidropatías de motivos de bucle corto de otras chaperonas moleculares independientes de ATP determinan sus actividades contra la agregación de proteínas amorfas. A partir de las correlaciones lineales entre la hidrofobicidad del motivo del bucle y la actividad de la chaperona contra la agregación amorfa (Fig. 4a, Fig. complementaria 8c), predijimos que el dominio BRICHOS de la gastrocina humana 2 (GKN2) (Fig. 1c, Fig. complementaria 1) reduciría la masa de agregación de CS al 65% (intervalo de confianza (IC) del 95%: 61–68%) y al 91% (IC del 95%: 84–97%) en una proporción de 1:1 y 1:0,5, respectivamente (Fig. 4d) . Los resultados experimentales correspondientes para los oligómeros BRICHOS wt GKN2 recombinantes fueron 80 ± 1,2% y 96 ± 5,2%, respectivamente (Fig. 4d). Las predicciones de estos tres motivos de bucle son sorprendentemente precisas considerando que la identidad general de secuencia por pares entre los dominios BRICHOS Bri2 y GKN2 completos es del 20%.

Para investigar si la correlación entre la hidrofobicidad del motivo del bucle y la actividad de las chaperonas se extiende a las sHSP, recurrimos a la αB-cristalina. El NTD de la sHSP αB-cristalina (también HSPB5) está parcialmente desordenado, tiene varios motivos hidrofóbicos y se ha demostrado que es importante para la unión de sustratos amorfos25. Reemplazamos parte de los bucles de wt Bri2 y wt proSP-C BRICHOS con los dieciocho residuos N-terminales de αB-cristalina. Este segmento NTD de cristalina αB tiene un patrón de motivo hidrófobo similar al bucle de wt Bri2 BRICHOS, pero no hay homología de secuencia con los bucles de ninguno de los dominios BRICHOS (Fig. 4c, Fig. Suplementaria 11a). Las quimeras αB Bri2 y αB proSP-C BRICHOS resultantes (Fig. 4c) forman grandes oligómeros polidispersos, aproximadamente 12–26 mers y 16–28 mers, respectivamente, y adoptan estructuras secundarias generales idénticas en comparación con los oligómeros Bri2 BRICHOS wt (Fig. 11b,c). Los oligómeros de las quimeras αB Bri2 y αB proSP-C BRICHOS son inhibidores tan eficientes de la agregación de proteínas amorfas como la αB-cristalina humana en peso39,40,41 o Bri2 BRICHOS en peso, mientras que proSP-C BRICHOS en peso está completamente inactivo (Fig. 4e). Curiosamente, para ambas quimeras, las eficiencias contra la agregación de proteínas amorfas predichas solo a partir de la hidrofobicidad biológica de los tres motivos en el NTD de cristalina αB, utilizando la regresión lineal derivada de nuestros datos (Fig. 4a, Fig. Suplementaria 8c), se ajustan casi exactamente con los datos experimentales correspondientes (Fig. 4d).

Los datos presentados en este documento muestran que la capacidad del dominio Bri2 BRICHOS para evitar que las proteínas sustrato parcialmente desnaturalizadas formen agregados amorfos está fuertemente correlacionada con la hidrofobicidad de tres motivos cortos que están ubicados en una región de bucle e intercalados por tramos polares cortos. Esto sugiere que las interacciones directas entre las regiones hidrófobas expuestas en los sustratos parcialmente desnaturalizados y los motivos de bucle hidrófobos de la chaperona son fundamentales para la capacidad de suprimir la agregación amorfa. El hecho de que los Bri2 BRICHOS monoméricos, diméricos o tetraméricos sean completamente inactivos para prevenir la agregación de proteínas amorfas11,37 apunta a que la formación de oligómeros más grandes es esencial. Descubrimos que la hidrofobicidad de los tres motivos de bucle corto determina en última instancia la actividad chaperona aparentemente al definir la afinidad del sitio de unión al sustrato, así como la disposición estructural cuaternaria en los oligómeros BRICHOS. La importancia esencial de la hidrofobicidad del bucle se demostró quizás más claramente mediante los intercambios de bucles de Bri2 BRICHOS o αB-cristalina, respectivamente, a proSP-C BRICHOS, que dieron como resultado chaperonas oligoméricas altamente eficientes, en contraste con las esencialmente completamente ineficientes proSP-wt. C trímeros BRICHOS (Fig. 4e).

Se cree que las chaperonas moleculares utilizan regiones intrínsecamente desordenadas para el reconocimiento de una amplia variedad de sustratos mal plegados. Las chaperonas moleculares independientes de ATP como HSP33, HSP21 o HdeA se despliegan parcialmente en condiciones de estrés para unir eficientemente a los clientes mal plegados42,43,44. Es intrigante que los motivos hidrofóbicos que aquí se determinan como esenciales para la actividad chaperona de los oligómeros Bri2 BRICHOS se encuentren en una región de bucle supuestamente no estructurada. La configuración del bucle y, por lo tanto, los sitios de unión expuestos en un oligómero Bri2 BRICHOS probablemente sean altamente dinámicos, lo que permite presentar grupos variables de residuos hidrofóbicos que contribuyen a la capacidad de interactuar con diversos sustratos. Además, los NTD dentro de la familia sHSP son muy variables en secuencia y longitud, pero se ha demostrado que son la clave de su capacidad para unirse a diversos sustratos25,28,45. Nuestros resultados respaldan firmemente que la exposición de parches hidrofóbicos desordenados flexibles en lugar de la identidad de secuencia media en la plasticidad del sustrato y la eficiencia contra la agregación de proteínas amorfas. La capacidad de formar oligómeros y exponer motivos hidrofóbicos es compartida entre BRICHOS y cristalinas, pero por lo demás estas dos familias son estructuralmente diferentes. Como se muestra aquí, BRICHOS necesita formar oligómeros más grandes que reúnan y expongan motivos hidrofóbicos para obtener una actividad chaperona canónica eficiente, mientras que las cristalinas generalmente se vuelven más activas al disociarse en subunidades más pequeñas27. La estrategia aparentemente simple para permitir interacciones BRICHOS-sustrato reuniendo motivos de bucle corto puede ser una manera de regular la actividad de las chaperonas en condiciones fisiológicas46 y la mutagénesis del dominio BRICHOS podría ser una forma de generar nuevas funciones de las chaperonas.

Todas las variantes del dominio Bri2 BRICHOS humano recombinante (residuos 113 a 231 de Bri2 BRICHOS humano), LS Bri2 BRICHOS, ΔL Bri2 BRICHOS, las quimeras BRICHOS αB Bri2 BRICHOS y αB proSP-C BRICHOS que albergan los residuos 1–18 de la cristalina αB humana (HspB5, número de acceso NCBI: P02511) y el bucle Bri2 BRICHOS aislado (residuos 187 a 216 de la proteína Bri2 humana) se clonaron en un vector pET32 modificado que contenía la etiqueta His6-NT* derivada de la seda de araña30, y se purificaron diferentes estados de ensamblaje11 . Se preparó proSP-C BRICHOS humano, correspondiente a los residuos de aminoácidos 59-197, y se aislaron oligómeros de LS proSP-C BRICHOS mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) utilizando una columna Superdex 200 (GE Healthcare) como último paso adicional. El fragmento genético del dominio BRICHOS de GKN2 humano, correspondiente a los residuos 21 a 151 de GKN2 humano, se clonó en un vector pET32 modificado que contenía la etiqueta His6-NT* y se expresó y purificó según el protocolo utilizado para Bri2 BRICHOS. Las mutaciones se introdujeron mediante PCR utilizando el kit de PCR KAPA HiFi HotStart ReadyMix (Kapa Biosystems, EE. UU.) o las construcciones se sintetizaron mediante la biotecnología GenScript. Todas las secuencias fueron confirmadas mediante secuenciación de ADN (Eurofins Genomics). Las concentraciones de proteína BRICHOS se determinaron midiendo la absorbancia a 280 nm utilizando los respectivos coeficientes de extinción. Todas las concentraciones dadas se basan en subunidades monoméricas.

Los espectros de dicroísmo circular (CD) se registraron a 25 °C en un espectrofotómetro CD J-1500 (JASCO) con un soporte de celda de termostato Peltier PTC-517. Se prepararon muestras de proteína de cinco o 10 µmol L-1 en 20 mmol L-1 NaPi, 0,2 mmol L-1 EDTA, pH 8,0 en una cubeta de vidrio de cuarzo con una longitud de paso de 1 mmol L-1. Se adquirieron cinco escaneos consecutivos por muestra entre 180 y 260 nm, con un incremento de 0,5 nm. Los espectros restados promediados y en blanco se convirtieron a la elipticidad media del residuo (MRE, grados cm2 dmol-1).

La SEC analítica se realizó utilizando una columna de aumento Superdex 200 usando un bucle de muestra de 500 µl. Se prepararon muestras de proteína de 10 µmol L-1 en 20 mmol L-1 de NaPi, 0,2 mmol L-1 de EDTA, pH 8,0, y se usó el mismo tampón como tampón de ejecución de SEC.

Para las mediciones de fluorescencia de triptófano, se prepararon proteínas recombinantes por triplicado en NaPi 20 mM, pH 8,0 con EDTA 0,2 mM con un volumen de 150 uL en placas de 96 pocillos de fondo plano de poliestireno negro (Costar) y se excitaron a 280 nm (ancho de banda de 5 mm). . La emisión de fluorescencia de 300 a 400 nm (ancho de banda de 10 mm, intervalo de paso de 1 nm) se registró utilizando un espectrofluorómetro (Tecan Saphire 2). Los datos se corrigieron restando la fluorescencia de fondo (tampón).

La agregación termoinducida de 0,6 µmol L-1 de citrato sintasa (CS) de corazón porcino (Sigma-Aldrich, Alemania) y 3 µmol L-1 de rodanasa de hígado bovino (Rho) (Merck; Darmstadt, Alemania) se siguió midiendo la absorbancia a 360 nm en ciclos de 90 s durante la incubación a 45 °C utilizando un lector de placas POLARstar Omega (BMG Labtech, Offenberg, Alemania). Las muestras se prepararon en placas de 96 pocillos de poliestireno de media área de fondo negro y transparente (Corning Glass 3881, EE. UU.) y el volumen de reactivo fue de 100 µl. Se prepararon soluciones madre de los sustratos modelo en 40 mmol L-1 HEPES/KOH, pH 7,5 (para CS), o PBS, pH 7,4 (para Rho) y se diluyeron en tampón que contenía 40 mmol L-1 HEPES/KOH, pH 7,5 (para CS) o PBS, pH 7,4 (para Rho). Las muestras se complementaron con 20 mmol L-1 NaPi, 0,2 mmol L-1 EDTA, pH 8,0 para condiciones de tampón iguales de las proteínas BRICHOS. Las mediciones se realizaron por triplicado y la cinética de agregación se analizó integrando el área bajo la curva, expresada como masa de agregación normalizada a la agregación de CS solo. Las relaciones molares indicadas se refieren a monómeros. Para la formación del complejo, se incubaron 0,6 µmol L-1 CS (Sigma-Aldrich, Alemania) con oligómeros 6 µmol L-1 rh Bri2 BRICHOS en 40 mmol L-1 HEPES/KOH pH 7,5 a 45 °C utilizando un lector de placas POLARstar Omega. (BMG Labtech, Offenberg, Alemania). El producto final se inyectó en una columna Superose 6 (Cytiva) y se eluyó con 20 mmol L-1 NaPi pH 8,0 que contenía 0,2 mmol L-1 EDTA, y se recogieron diferentes fracciones para análisis SDS-PAGE y PAGE nativa. El complejo BRICHOS-CS se aplicó a rejillas de cobre recubiertas de carbono (malla 400, estándares analíticos), se tiñó negativamente con ácido fosfotúngstico (PTA) al 1% y se observó bajo microscopía electrónica de transmisión (TEM, Jeol JEM2100F a 200 kV).

Se produjo Aβ(1–42) recombinante, aquí denominado Aβ42, fusionado a la etiqueta de solubilidad NT* en células BL21*(DE3) de E. coli y la proteína de fusión NT*-Aβ42 se purificó mediante cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC )47. El NT*-Aβ42 purificado se escindió mediante la proteasa del virus del grabado del tabaco (TEV) durante la noche en una cámara fría, se liofilizó y se volvió a disolver en 7 moles L-1 de Gdn-HCl. Los monómeros de Aβ42 se aislaron en 20 mmol L-1 de fosfato sódico, pH 8,0, con 0,2 mmol L-1 de EDTA mediante una columna Superdex 30 (GE Healthcare, Reino Unido). La concentración monomérica de Aβ42 se calculó utilizando un coeficiente de extinción de 1 424 M-1 cm-1 para (A280-A300). Para la fibrilación de Aβ42, se agregaron en pocillos de microplacas de 384 pocillos de media área con fondo transparente (Corning Glass 3766, EE. UU.) y se incubaron a 37 °C en condiciones de reposo. La fluorescencia ThT se registró con un filtro de excitación de 440 nm y un filtro de emisión de 480 nm utilizando un lector de microplacas (FLUOStar Galaxy de BMG Labtech, Offenberg, Alemania). Para todos los experimentos, las trazas de agregación se normalizaron y promediaron utilizando cuatro réplicas, y los datos para un conjunto de experimentos se registraron en la misma placa.

Los perfiles de agregación de Aβ42 en presencia de diferentes concentraciones de variantes de BRICHOS se ajustaron a una ecuación sigmoidea empírica (Ec. (1))48,49, y el tiempo medio de agregación \({{\tau }}_{1/2} \) y la tasa de crecimiento máxima \({r}_{\max }\).

donde A es la amplitud y F0 el valor base.

Las trazas de agregación de la concentración total de masa de fibrillas, M(t), se describen mediante la siguiente ley de velocidad integrada32:

donde los coeficientes adicionales son funciones de λ y κ:

que son dos combinaciones de las constantes de velocidad microscópicas por \(\lambda =\sqrt{2\cdot {k}_{+}{k}_{n}\cdot m{\left(0\right)}^{{ n}_{C}}}\) y \(\kappa =\sqrt{2\cdot {k}_{+}{k}_{2}\cdot m{\left(0\right)}^{ {n}_{2}+1}}\). Las constantes de velocidad microscópicas kn, k+ y k2 son las constantes de velocidad de nucleación primaria, alargamiento y nucleación secundaria, respectivamente, y los parámetros nC y n2 son los órdenes de reacción para la nucleación primaria y secundaria, respectivamente.

Identificamos los eventos microscópicos inhibidos por las variantes de BRICHOS aplicando la ecuación. (2) describir los perfiles de agregación macroscópicos. Los datos cinéticos a una concentración constante de Aβ42 con diferentes concentraciones de BRICHOS se analizaron globalmente aplicando el modelo de nucleación cinética, donde el ajuste se limitó de modo que un parámetro de ajuste se mantuvo en un valor constante en todas las concentraciones de especies/variantes de BRICHOS, mientras que el segundo parámetro se mantuvo en un valor constante en todas las concentraciones de especies/variantes de BRICHOS. el único parámetro libre. Este procedimiento da como resultado que sólo una constante de velocidad, es decir, kn, k+ o k2, sea el único parámetro de ajuste49.

Los datos de agregación de proteínas para probar las actividades de las chaperonas y los datos de fluorescencia de ThT se presentan como medias ± desviación estándar, y las trazas de agregación se promedian a partir de 3 a 4 réplicas.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Todos los datos y materiales relacionados con este artículo están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable. Las imágenes de gel sin recortar se incluyen como Figura complementaria 12. Los datos sin procesar se compilan en Datos complementarios.

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Descargar referencias

Los autores agradecen a Stefan Knight y Wangshu Jiang por la identificación y clonación del dominio ΔL Bri2 BRICHOS. Este estudio fue apoyado por el Consejo Sueco de Investigación (JJ), la Fundación Sueca del Cerebro (JJ) y el Centro de Medicina Innovadora (CIMED) (JJ), la Beca de Investigación de la Asociación de Alzheimer (GC), la Olle Engkvists Stiftelse (GC) , Petrus and Augusta Hedlunds Stiftelse (GC, AA), Swedish Alzheimer Foundation (GC), Åhlén-stiftelsens (GC, AA), Karolinska Institutet Research Foundation Grant (GC, AA), Stiftelsen för Gamla Tjänarinnor (GC, AA), AA), la Fundación Loo y Hans Osterman (GC, AA), la Fundación de Enfermedades Geriátricas del Instituto Karolinska (GC, AA), la Fundación Gun y Bertil Stohne (GC), Stiftelsen Sigurd och Elsa Goljes Minne (GC), Åke Wibergs stiftelse (GC, AA), Sociedad Sueca de Investigación Médica (AA), FORMAS (AA) y la fundación Magnus Bergvall (GC, AA). Programa Dora Pluss financiado por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional y la República de Estonia (HP).

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por el Instituto Karolinska.

Axel Leppert

Dirección actual: Departamento de Microbiología, Biología Celular y Tumoral, Karolinska Institutet, 171 65, Solna, Suecia

Estos autores contribuyeron igualmente: Gefei Chen, Axel Leppert.

Fallecida: Harriet E. Nilsson.

Departamento de Biociencias y Nutrición, Karolinska Institutet, 141 83, Huddinge, Suecia

Gefei Chen, Axel Leppert, Helen Poska, Carlos Piedrafita Alvira, Axel Abelein & Jan Johansson

Facultad de Ciencias Naturales y Salud, Universidad de Tallin, Tallin, Estonia

Helen Poska

Facultad de Ciencias de la Ingeniería en Química, Biotecnología y Salud, Departamento de Ingeniería Biomédica y Sistemas de Salud, KTH Royal Institute of Technology, 141 52, Huddinge, Suecia

Harriet E. Nilsson, Xueying Zhong, Philip Koeck, Caroline Jegerschöld y Hans Hebert

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GC, AL, HP, HEN, CPA y XZ realizaron experimentos. GC, AL, HP, HEN, CPA, PK, CJ, AA, HH y JJ analizaron los datos. GC, AL, AA y JJ concibieron y diseñaron experimentos. JJ organizó la investigación. GC, AL, HP y JJ escribieron el artículo. Todos los autores comentaron el manuscrito.

Correspondencia a Gefei Chen o Jan Johansson.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses

Este manuscrito ha sido revisado previamente en otra revista de Nature Portfolio. Communications Biology agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editor principal: Gene Chong.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Chen, G., Leppert, A., Poska, H. et al. Los motivos de bucle hidrófobos cortos en los dominios BRICHOS determinan la actividad de las chaperonas contra la agregación de proteínas amorfas, pero no contra la formación de amiloide. Común Biol 6, 497 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04883-2

Descargar cita

Recibido: 07 de julio de 2022

Aceptado: 27 de abril de 2023

Publicado: 08 de mayo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04883-2

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